克羅諾桿菌的危害
克羅諾桿菌是一種條件致病菌，高風(fēng)險(xiǎn)人群主要是嬰幼兒，特別是早產(chǎn)兒、低出生體重兒和免疫力低下人群，可引起嚴(yán)重的壞死性小腸結(jié)腸炎、菌血癥和腦膜炎等疾病，死亡率高達(dá)40%~80%。
因?yàn)樵摼膹?qiáng)致病性、高死亡率以及易感人群的特殊性。所以，嬰幼兒配方食品中克羅諾桿菌屬檢測(cè)是非常重要且必不可少的檢測(cè)項(xiàng)目。國內(nèi)外相關(guān)食品安全標(biāo)準(zhǔn)均明確規(guī)定嬰幼兒配方食品中不得檢出克羅諾桿菌屬。
為何進(jìn)行黃色素實(shí)驗(yàn)？
在克羅諾桿菌屬檢測(cè)中，黃色素實(shí)驗(yàn)一直是非常重要的鑒定步驟，后續(xù)生化也是在產(chǎn)黃色素的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。
黃色素實(shí)驗(yàn)之所以重要，要從克羅諾桿菌屬的命名史說起。1980年之前根據(jù)生化反應(yīng)和產(chǎn)生黃色素等特征該菌被認(rèn)為是產(chǎn)黃色素的陰溝腸桿菌；1980年命名為阪崎腸桿菌；2008年劃分為獨(dú)立的新屬克羅諾桿菌屬。所以，一直以來黃色素實(shí)驗(yàn)都作為克羅諾桿菌屬鑒定的重要依據(jù)。
黃色素實(shí)驗(yàn)特殊的培養(yǎng)溫度
GB4789.40-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)??食品微生物學(xué)檢驗(yàn)克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)?檢驗(yàn)》中要求，從顯色培養(yǎng)基挑取可疑菌接種TSA平板，25℃±1℃?培養(yǎng)48h±4h。挑取黃色可疑菌落進(jìn)行后續(xù)鑒定。
黃色素實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)溫度有別于其他步驟的培養(yǎng)溫度，因?yàn)樵?5℃±1℃培養(yǎng)條件下更利于黃色素的產(chǎn)生。
下面我們用克羅諾桿菌屬的標(biāo)準(zhǔn)菌株及樣品分離株對(duì)培養(yǎng)溫度進(jìn)行驗(yàn)證。菌株劃線TSA平板分別置于25℃及36℃培養(yǎng)48h，觀察黃色素產(chǎn)生情況。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖所示：
從實(shí)驗(yàn)圖片可以得出結(jié)論：36℃培養(yǎng)48h菌落生長(zhǎng)更大，但是多數(shù)菌株黃色素的產(chǎn)生比25℃培養(yǎng)48h要差。有些菌株差異不大。因此，進(jìn)行黃色素實(shí)驗(yàn)時(shí)，TSA平板需要放置于25℃±1℃進(jìn)行培養(yǎng)。
通過實(shí)驗(yàn)不僅可以看到不同培養(yǎng)溫度對(duì)于黃色素產(chǎn)生的影響；也可以看到即便是25℃進(jìn)行培養(yǎng)，不同菌株產(chǎn)生的黃色素也不完全一致。顏色深淺差異很大，有些菌株甚至基本不產(chǎn)生黃色素。而且國外的研究也發(fā)現(xiàn), 近 8%的克羅諾桿菌屬不產(chǎn)黃色素。如果只依據(jù)黃色素來決定后續(xù)是否進(jìn)行生化鑒定，很容易造成假陰性。
所以，《ISO 22964：2017 Microbiology of the food chain-Horizontal method for the detection of?Cronobacter?spp》標(biāo)準(zhǔn)中，TSA平板上黃色素觀察不再作為生化鑒定的項(xiàng)目。
綜上所述，在進(jìn)行克羅諾桿菌屬檢測(cè)時(shí)，如果顯色培養(yǎng)基上菌落典型，即便TSA上黃色素不明顯也建議進(jìn)行生化鑒定。最終根據(jù)生化鑒定結(jié)果進(jìn)行綜合判定。
參考文獻(xiàn)
1、GB4789.40-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)?食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)?檢驗(yàn)
2、ISO 22964: 2017 Microbiology of the food chain-Horizontal method for the detection ofCronobacter?spp.
3、萬志剛，呂敬章，趙琳娜，等.α-葡萄糖苷酶試驗(yàn)在克羅諾桿菌鑒定中的應(yīng)用[J]. 食品安全質(zhì)量檢驗(yàn)學(xué)報(bào),2009,10(16) :5432~5435
4、Iversen C, Lehner A, Mullane N,?et al. Identification of 'Cronobacter' spp.(Enterobacter sakazakii) [J]. J Clin Microbiol, 2007, 45(11): 3814-381